西医考研考点定位标记每天学（第72天）

常用分子生物学技术的原理及其应用

(1) 分子杂交和印迹技术

①分子杂交：确定单链核酸碱基序列的技术，其基本原理是待测单链核酸与已知序列的单链核酸（叫做探针）通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段。这种技术可在DNA 与DNA，RNA 与RNA，或DNA 与RNA 之间进行，形成DNA-DNA，RNA-RNA 或RNA-DNA 等不同类型的杂交分子。

②印迹技术：印迹技术是指将待测核酸分子结合到一定固相支持物上的方法，包括DNA 印迹技术、RNA印迹技术和蛋白质印迹技术三大类。

(2)PCR 技术的原理与应用

②几种重要的PCR 衍生技术

Ⅰ. 转录PCR 技术（ RT-PCR）：是将RNA 的逆转录反应和PCR 反应联合应用的一种技术。即首先以RNA 为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA ，再以cDNA 为模板通过PCR 反应来扩增目的基因。RT-PCR 是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA 进行定性和半定量分析的最有效方法。

Ⅱ. 原位PCR 技术：是在甲醛溶液（福尔马林）固定、石蜡包埋的组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR 反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA 或RNA 是否在该组织或细胞中存在。由于常规PCR 与RT-PCR 技术的产物不能在组织细胞中直接定位，因而不能与特定的组织细胞特征表型相联系，而原位杂交技术虽有良好的定位效果，但检测灵敏度不高。原位PCR 方法弥补了PCR 技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。

Ⅲ. 实时PCR 技术：常规PCR 反应中产物以指数形式增加，在比较不同来源样品的DNA 或cDNA 含量时，产物的堆积将影响对检测样品中原有模板含量差异的准确判断，因而只能作为半定量手段应用。实时PCR 技术通过动态监测反应中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦称为定量RCR 或实时定量PCR。实时PCR 的基本原理是引入了荧光标记分子，并使荧光信号强度与PCR 产物量成正比，对每一反应时刻的荧光信号进行实时分析，即可计算出PCR 产物量。